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实验考马斯亮蓝测蛋白质含量.doc

实验考马斯亮蓝测蛋白质含量

2019-06-28 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《实验考马斯亮蓝测蛋白质含量doc》,可适用于工程科技领域

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实验考马斯亮蓝考G染色法测定蛋白质含量一、目的、学习一种蛋白质染色测定的方法、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G在酸性溶液中为棕红色其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力通过疏水作用与蛋白质相结合形成蓝色的蛋白质染料复合物在nm处有最大吸光度在一定的蛋白质浓度范围内蛋白质染料符合物在nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比因此可用于蛋白质含量测定。反应mdash分钟即呈最大光吸收至少稳定小时。在mdashmg蛋白质ml范围内均可。该法操作简便迅速消耗样品量少但不同蛋白质之间差异大且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强比色杯不洗干净会影响光吸收值不可用石英怀测定。三、材料、试剂与器具(一)试剂、染色液:取考马斯亮蓝Gmg溶于ml乙醇中加ml磷酸加水稀释至升。棕色瓶保存该染色液可保存数月若不加水可长期保存用前稀释。、标准蛋白溶液:mgml牛血清白蛋白。、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制浓度控制在mdashmgml(二)器具、试管及试管架、移液管(ml,ml)、可见光分光光度计四、操作步骤(一)标准曲线的制作、取支试管按下表加入试剂试管编号蛋白标准溶液蒸馏水考马斯亮蓝、将试管摇匀放置分钟。、用分光光度计比色测定吸光值Anm。、以Anm为纵坐标标准蛋白色质浓度为横坐标绘制标准曲线。(二)样品的测定、取一支试管加入未知浓度的蛋白质溶液ml蒸馏水ml考马斯亮蓝试剂ml、将试管摇匀放置分钟。、比色测定吸光值Anm对照标准曲线求得蛋白质的浓度。五、注意事项、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低因而当蛋白质浓度较大时标准曲线稍有弯曲但直线弯曲程度很轻不致影响测定、测定工作应在蛋白质染料混合后min开始力争hr内完成否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。六、实验报告绘制标准曲线并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。七、思考题、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么?、考马斯亮蓝法有什么优缺点Bradford法的优点是()灵敏度高其最低蛋白质检测量可达mug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大蛋白质染料复合物有更高的消光系数因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。()测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定只需要min左右颜色在min至min之间稳定性也很好。()干扰物质相对其它方法少。缺点是()由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。()仍有些物质干扰此法测定:去污剂、TritonX、十二烷基硫酸钠(SDS)和molL的NaOH。()标准曲线也有轻微的非线性。操作注意事项:不可使用石英比色皿(染色不易洗掉)可用塑料或者玻璃比色皿使用后立即用少量的乙醇荡洗以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。分光光度计的操作使用①在接通电源前应对仪器的安全性进行检查电源线接线应牢固接地线通地要良好各个调节旋钮的起始位置应该正确然后再接通电源。②将灵敏度派或调至ldquordquo档(放六倍率最小)。调波长调节器至所需波长。③开启电源开关指示灯亮选择开关置于ldquoTrdquo调节透光度ldquo%rdquo旋钮使数字显示ldquordquo左右预热分钟。④打开吸收池暗室盖(光门自动关闭)调节ldquordquo旋钮使数字显示为ldquordquo盖上吸收池盖将参比溶液置于光路使光电管受光调节透光度ldquo%rdquo旋钮使数字显示为ldquordquo。⑤如果显示不到ldquordquo则可适当增加电流放大器灵敏度档数但应尽可能使用低档数这样仪器将有更高的稳定性。当改变灵敏度后必须按④重新校正ldquordquo和ldquordquo。⑥按④连续几次调整ldquordquo和ldquordquo后将选择开关置于A调节吸光度调零旋钮使数字显示ldquordquo。然后将待测溶液推入光路显示值即为待测样品的吸光度值A。⑦浓度C的测量。选择开关由ldquoArdquo旋至ldquoCrdquo将标准溶液推入光路调节浓度旋钮。使得数字显示值为已知标准溶液浓度数值。将待测样品溶液推入光路即可读出待测样品的浓度值。⑧如果大幅度改变测试波长时在调整ldquordquo和ldquordquo后稍等片刻(因光能量变化急剧光电管受光后响应缓慢需一段光响应平衡时间)当稳定后重新调整ldquordquo和ldquordquo即可工作。五、注意事项比色皿使用注意事项:①拿取比色皿时手指不能接触其透光面②装溶液时先用该溶液润洗比色皿内壁~次测定系列溶液时通常按由稀到浓的顺序测定③被测溶液以装至比色皿的高度为宜④装好溶液后先用滤纸轻轻吸去比色皿外部的液体再用擦镜纸小心擦拭透光面直到洁净透明⑤一般参比溶液的比色皿放在第一格待测溶液放在后面三格。

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