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小黑杨?PnsICE1?基因的植物表达载体构建及遗传转化.doc

小黑杨?PnsICE1?基因的植物表达载体构建及遗传转化

hao贞
2019-02-20 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《小黑杨?PnsICE1?基因的植物表达载体构建及遗传转化doc》,可适用于综合领域

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小黑杨PnsICE基因的植物表达载体构建及遗传转化作者:王艳敏 张妍妍 白卉来源:《安徽农业科学》年第期摘要目的构建PnsICE基因的植物表达载体并进行拟南芥遗传转化以期为进一步研究小黑杨PnsICE基因功能提供材料。方法以pROKⅡ载体为骨架利用InFusion连接方法构建由CaMVS调控的小黑杨PnsICE基因植物表达载体用农杆菌介导法对拟南芥进行遗传转化。结果通过PCR检测结果证明PnsICE基因已整合到拟南芥基因组中获得株转PnsICE基因拟南芥。结论植物表达载体的构建及转基因植株的获得为研究小黑杨PnsICE基因功能提供材料。关键词小黑杨PnsICE遗传转化中图分类号SQ文献标识码A文章编号()低温伤害是世界上普遍存在的问题也是造成农林业生产损失巨大的一种严重自然灾害。研究并提高植物耐寒能力具有重要的理论意义和现实意义。随着生物技术的发展导入外源基因提高植物抗逆性已成为现代植物育种的主要手段。ICE(inducerofCBFexpression)也被称为诱导CBF表达基因是能够调节冷诱导基因(coldregulatedCOR)表达的最上游转录因子。它编码一个类似转录激活基因(MYC)的bHLH转录因子在常温下钝化在低温下能够特异地结合CBF启动子中的MYC作用元件诱导CBF的表达CBF进一步结合到其下游目的基因启动子的DRE序列诱导下游一系列冷诱导基因以及其他在植物寒冷适应中起作用基因的表达继而提高转基因植株的抗寒性。现已知转ICE基因的拟南芥、柑橘、甜杨、苹果、大花蕙兰、水稻、烟草与非转基因植株相比抗寒性都得到了提高。笔者利用InFusion连接方法构建小黑杨PnsICE基因植物表达载体并转化拟南芥获得T代转基因拟南芥为进一步研究小黑杨PnsICE基因功能提供材料。材料与方法材料哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana):生态型Columbia(Col)种植于人工土(黑土∶蛭石∶珍珠岩=∶∶)中。菌株与载体:大肠杆菌感受态(Esherichiacoli)Top购自北京原平皓生物技术有限公司。根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA由黑龙江省林业科学研究所速生林木培育重点验室保存。pROKⅡVector由山东农业大学惠赠。高效连接试剂盒InFusionAdvantagePCRCloningKit、TDNA连接酶、TaqDNA聚合酶、dNTPMixture、DNA分子量标准DL均购自TaKaRa公司。限制性内切酶均购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司公司(Promegahttp:wwwpromegacom)。抗生素:利福平(RifampicinRif)、羧苄青霉素(CarbenicillinCab)、乙酰丁香酮(AcetosyringoneAS)购自北京国药化学试剂有限公司(http:wwwcrcbjcom)卡那霉素(KanamycinKan)和氨苄青霉素(AmpicillinAmp)购自Sigma公司。所用引物及测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成及完成(Sangonhttp:wwwsangonbiogonet)引物序列:PnsICEOEF:′TCGAGCTCGGTACCCATGCTTTATAGACTCAATAGC′PnsICEOER:′CTCTAGAGGATCCCCCTACATCGCGCCATGGAAGCC′pROKⅡF:′GGCGAACGTGGCGAGAAAGG′pROKⅡR:′ACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC′。PnsICE基因植物表达载体构建以之前获得的阳性克隆pMDTPnsICE质粒为模板PnsICEOEF和PnsICEOER为引物(下划线为引入pROKⅡ同源互补序列)利用PCR方法引入pROKⅡ质粒线性化末端的同源互补序列。PCR扩增体系:DNAμl×ExTaqPCRbufferμlmmolLdNTPMixμlμmolL引物各μlUμlExTaqμl补水至μl。PCR反应程序:℃预变性s℃变性s、℃退火s、℃延伸min共个循环℃延伸min℃保存。取μlPCR产物进行电泳检测以DLDNAMarker为参照。回收PCR产物用限制性内切酶SmaI对pROKⅡvector进行单酶切。将目的基因(PnsICE)片段与pROKⅡvector的连接反应连接产物转化大肠杆菌阳性克隆PCR检测。挑取阳性克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序成功的重组质粒转化农杆菌进行农杆菌菌液检测。浸花法转化拟南芥采用蘸花法进行拟南芥的遗传转化将盛花期的拟南芥的花序浸泡在含有过表达质粒农杆菌的浸染液中蔗糖、μmolL乙酰丁香酮的MS液体培养基(pH)OD≈s期间轻轻摇动取出后室温放置min再侵染一次。侵染过的植株需保湿h后用水喷雾将转化植株彻底清洗一次。~d收集种子加入适量变色硅胶保持干燥。标记为T代℃保存。转基因拟南芥的T代种子表面消毒后铺于含mgLKan的筛选培养基上进行逐代筛选直至获得T代种子利用pROKⅡ载体引物对筛选出的抗性苗进行PCR检测。结果与分析PnsICE基因植物表达载体构建以之前获得的阳性克隆pMDTPnsICE质粒为模板PnsICEOEF和PnsICEOER为引物利用PCR的方法引入pROKⅡ质粒线性化末端的同源互补序列(图A)。提取pROKⅡ质粒(图B)用限制性内切酶SmaⅠ对pROKⅡvector进行单酶切(图C)利用InFusion连接方法将质粒与目的片段相连接将连接产物转化大肠杆菌感受态挑取个单克隆进行初步的菌液PCR检测获得一个阳性转化子目的条带为bp左右(图D)将通过菌落PCR验证目的片段正确的一个单克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序经序列比对成功后提取阳性质粒。将阳性质粒转化农杆菌挑取个单克隆将农杆菌菌液进行PCR检测结果显示均为阳性转化子(图E)保存菌种用于下一步的拟南芥遗传转化。PnsICE基因过表达植物的鉴定转基因拟南芥的T代种子表面消毒后铺于含mgLKan的筛选培养基上(图A)进行逐代筛选直至获得T代转基因拟南芥(图B)利用pROKⅡ载体引物对筛选出的抗性苗进行PCR检测(图)获得的株转基因拟南芥均获得与阳性对照相同目的条带而野生型对照植株未检测到目的条带初步说明PnsICE基因已整合到拟南芥基因组中。讨论构建林木重要基因植物表达载体并获得过表达植株继而研究其功能对于阐明多年生木本植物抗寒调控的分子机制具有重要的理论意义。研究表明植物ICEI转录因子在常温下钝化在低温下能够特异地结合CBF启动子中的MYC作用元件诱导CBF的表达CBF进一步结合到其下游目的基因启动子的DRE序列从而诱导下游一系列冷诱导基因以及其他在植物寒冷适应中起作用的基因的表达继而提高转基因植株的抗寒性。该研究将之前从小黑杨中获得的pnSICE基因利用InFusion连接方法成功构建植物过表达载体并转化拟南芥成功获得株T代转基因拟南芥为进一步研究小黑杨PnsICE基因功能、PnsICE转录因子调控机制提供材料。参考文献PEARCERSMolecularanalysisofacclimationtocoldJPlantGrowthRegul():CHINNUSAMYVOHTAMKANRARSetalICE:aregulatorofcoldinducedtranscriptomeandfreezingtoleranceinArabiopsisJGenesDevelopment():LEEBHENDERSONDAZHUJKTheArabidopsiscoldresponsivetranscriptomeanditsregulationbyICEJPlantCell:BADAWIMREDDYYVAGHARBAOUIZetalStructureandfunctionalanalysisofwheatice(InducerofCBFExpression)genesJPlantCellPhysiology():张瑜向殿军殷奎德农杆菌介导的大花蕙兰转ICE基因J中国农学通报():向殿军满丽莉殷奎德拟南芥ICE基因转化水稻的进一步研究J生物技术通报():郑银英崔百明常明进等转拟南芥ICE基因增强烟草抗寒性的研究J西北植物学报():黄家权抗寒基因的克隆及根癌农杆菌介导的ICE基因转化柑橘的研究D武汉:华中农业大学林元震张志毅刘纯鑫等甜杨抗冻转录因子ICE基因的insilico克隆及其分析J分子植物育种():赵玲玲苹果MdSAMDC和MdICE基因的功能鉴定以及抗逆性研究D泰安:山东农业大学轩春雷肖向文李晓波等盐芥ICE转录因子的克隆及生物信息学分析J生物技术通报():XUWRJIAOYTLIRMetalChinesewildgrowingVitisamurensisICEandICEencodeMYCtypebHLHtranscriptionactivatorsthatregulatecoldtoleranceinarabidopsisJPlosOne():DONGCZHANGZRENJetalStressresponsivegeneICEfromVitisamurensisincreasescoldtoleranceintobaccoJPlantPhysiologyandBiochemistry:CLOUGHSJBENTAFFloraldipAsimplifiedmethodforAgrobacteriummediatedtransformationofArabidopsisthalianaJPlant:CHENLCHENYJIANGJetalTheconstitutiveexpressionofChrysanthemumdichrumICEinChrysanthemumgrandiflorumimprovestheleveloflowtemperaturesalinityanddroughttoleranceJPlantCellReports():FENGHLMANNMENGXetalAnoveltomatoMYCtypeICEliketranscriptionfactorSlICEaconferscoldosmoticandsalttoleranceintransgenictobaccoJPlantPhysiologyandBiochemistry:MIURAKJINJBLEEJetalSIZmediatedsumoylationofICEcontrolsCBFDREBAexpressionandfreezingtoleranceinArabidopsisJThePlantCell():XUWJIAOYLIRetalChinesewildgrowingVitisamurensisICEandICEencodeMYCtypebHLHtranscriptionactivatorsthatregulatecoldtoleranceinArabidopsisJPlosOne():

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